Durante su segundo año de enseñanza se vio incapacitado por enfermedad, pero tuvo fuerza  suficiente para prepararse para el sacerdocio, que recibió en 1622 en Pontoise. Desde 1622 a 1625  permaneció en el Collège de Rouen, donde desempeñó el oficio de mayordomo. Más tarde fue escogido para las misiones en Nueva Francia por el provincial de Francia, Padre Pierre Coton. Navegó desde Dieppe en Abril de 1625 y desembarcó en Quebec en junio, junto con los Padres Charles Lalemant y Énemond Massé y dos hermanos laicos, François Charton y Gilbert Burel.

Cinco meses de una existencia errante entre el frío y la nieve (20 de octubre de 1625–27 de marzo de 1626) con un grupo de indios montañeses que vivían cerca de Quebec constituyeron su aprendizaje para la vida misionera. Escasamente se había iniciado en el idioma y costumbres de los Algonkins cuando el mismo año 1626 su superior lo designó, con el Padre Anne de Nouë, para el territorio Huron. En julio por primera vez Brébeuf recorrió en canoa los 1280 kilómetros que separan Quebec del territorio de los hurones. Las páginas que escribió después sobre las condiciones de este viaje hacen de él, junto con Champlain, Sagard, Chaumonot, y Allouez, uno de los cronistas principales de esta gran ruta al Oeste que misioneros, comerciantes y exploradores anhelaron seguir. Éste fue un viaje agotador de 20 a 30 días lleno de dificultades. Vivió con los nativos de Hurón cerca del lago Hurón, aprendiendo sus costumbres e idioma, del que se volvió un experto (se dice que escribió el primer diccionario del idioma hurón). Ha sido llamado el "primer etnógrafo serio" de Canadá. En una colonia en que la existencia y crecimiento dependía principalmente del comercio de pieles, los Hurones eran aliados preciosos. De hecho, los Hurones formaban un grupo compacto, sedentario, agrícola, dotado de un genio real para el comercio.

Estatua de Jean de Brébeuf en Trois-Riviéres, Quebec, Canadá

En 1629 Brébeuf regresó de prisa a Quebec. Estaba presente cuando el puesto fue capturado por los Kirkes en julio y seguidamente tuvo que volver a Francia con los otros misioneros de la colonia. Se estableció en Rouen y fue asignado para servir la Iglesia como predicador y confesor. Fue en este momento (enero de 1630) que hizo sus votos finales como Jesuita. Desde 1631 a 1633 lo encontramos en el Collège de Eu, actuando como mayordomo, ministro y confesor al mismo tiempo. Brébeuf volvió a Nueva Francia en 1633, y el año siguiente entró de nuevo en el país de los hurones, acompañado por los Padres Antoine Daniel y Ambroise Davost.

Esta vez su superior, Paul Le Jeune Padre, le confió la tarea de fundar y organizar una misión real. Después de una fase relativamente satisfactoria el trabajo de evangelización encontró pronto resistencia obstinada y creciente entre los hurones. Brébeuf atribuyó esta resistencia a tres factores: la inmoralidad de los hurones, su atadura a las costumbres del país, es decir, a todo lo que hasta entonces había constituido su mundo de creencias y placeres, y finalmente las epidemias que asolaron el país.

Este último factor en particular retardó el flujo de conversiones grandemente. Las epidemias de 1634 (la viruela combinada con disentería), 1636 (influenza maligna), y 1639 (viruela), redujo a 12.000 una población que Sagard, Brébeuf, y Champlain estimaron en 30.000 almas. El contacto con los europeos fue desastroso para los indios americanos, tomados por sorpresa por los virus que se habían traído de Europa. La epidemia de 1636–37 despertó la nación entera contra Brébeuf y sus compañeros. Durante meses en extremo encendidos, bajo la dirección de los hechiceros, en los que se desarrolló una diestra campaña, compuesta de insinuaciones hipócritas, luego de abiertas y violentas amenazas que fueron acompañadas por intentos de asesinato. En el otoño de 1637 la misión entera casi se derrumbó.

A fines de agosto de 1638, después de fundar un tercer puesto en Teanaostaiaë (San-Joseph II), Brébeuf entregó la dirección de la misión al padre Jérôme  Lalemant que había llegado recientemente de Francia. Él se convirtió en el superior de la residencia que recién había fundado. Fue en este ministerio que Brébeuf tuvo que sufrir la persecución más áspera de su carrera. Después de una epidemia de viruela se repitieron los eventos dramáticos de 1637, pero organizado aun más tumultuosamente: se derribaron las cruces, se tiraron piedras en la capilla, hubo palizas y amenazas con hachas de mano y las ascuas encendidas.

Edición discográfica con "Jesous Ahatonhia" de Jean de Brébeuf

Brébeuf relató muchas de sus experiencias en Canadá en las "Jesuit Relations", una fuente inestimable de historia de los primeros canadienses. Su éxito como misionero fue muy lento y sólo en 1635 logró sus primeras conversiones. Declaraba haber hecho 14 a partir de 1635, y a partir de 1636 decía que el número subió a 86. Los Jesuitas frecuentemente eran culpados de desastres como epidemias, derrotas en las batallas y fracasos de la cosecha y una vez Brébeuf fue condenado a muerte y otra vez azotado.

Intentó infructuosamente convertir la Nación Neutral de Lake Erie en 1640. Después de esto la misión falló, volvió a Quebec en la primavera de 1642 y se quedó allí durante dos años y medio. En 1643 escribió el Carol Huron "Jesous Ahatonhia", un villancico de Navidad que todavía es, en una misma versión modificada, usado hoy. Volvió a Hurón en  septiembre de 1644 y finalmente experimentó algún éxito. Hacia 1647 había miles de hurones convertidos.

La presencia carismática de Brébeuf en el país de los hurones ayudó a causar una división entre los hurones tradicionalistas y los que quisieron adoptar la cultura europea. Sin embargo, los iroqueses, armados e incentivados por los colonos holandeses que buscaban eliminar la competencia comercial francesa empezaron a ganar su guerra contra los hurones. Destruyeron un gran pueblo hurón en 1648 y el 16 de marzo de 1649, 1200 iroqueses capturaron la misión de St. Ignace y luego unas horas después capturaron otro pueblo hurón donde capturaron a Brébeuf y su compañero jesuita Gabriel Lallemant y los llevaron a St. Ignace.

Allí los prisioneros fueron atados a estacas y torturados hasta la muerte quitándoles el cuero cabelludo, simulando un bautismo con agua hirviendo, fuego, collares de hachas calientes al rojo y mutilación. Según la tradición católica, Brébeuf no dio un solo grito mientras era torturado lo que asombró a los iroqueses, quienes más tarde sacaron su corazón y lo comieron con la esperanza de  obtener su valor.  Brébeuf tenía cincuenta y cinco años.

El cadáver de Brébeuf fue recuperado unos días después. Su cuerpo fue hervido  para  quitarle la carne, y los huesos se convirtieron en reliquias de la iglesia. Su carne fue enterrada, junto con Lalemant, en un ataúd, y hoy permanecen en la Iglesia de St. Joseph en la reconstruida misión jesuita de Sainte-Marie entre los hurones, cerca de Midland, Ontario.

Brébeuf fue canonizado el 29 de junio de 1930 por el papa Pio XI y proclamado por Pio XII el 16 de octubre de 1940 santo patrón de Canadá, junto con siete otros misioneros, conocidos como los Mártires de Norte América o Mártires Canadienses. Fue conocido como "El Apóstol de los Hurones". Los hurones (Ouendat) lo llamaban "Echon" (pronunciado "Ekon"), nombre que significa "Árbol Curativo", como una representación de cuánto Brébeuf había ayudado a los hurones y de las medicinas que les trajo de Europa.