Nada se sabe acerca de sus estudios musicales. Se lo menciona por primera vez en Mantua en 1572 como un sub-diácono en la Basílica Palatina de Santa Bárbara. El año siguiente fue promovido al puesto de diácono, cargo que conservó hasta por lo menos 1574. A fines de 1575, poco antes de ordenarse sacerdote, se concedió a Gastoldi una mansionaria (a cargo de una capilla) en Santa Bárbara. Desde septiembre de 1579 hasta agosto de 1587 enseñó contrapunto a los novicios en la basílica; los archivos lo mencionan por primera vez como cantante en 1581. En 1582 el cardenal Carlo Borromeo solicitó que se permitiera a Gastoldi entrar a su servicio en Milán; el Duque Guglielmo Gonzaga contestó que de ninguna manera se permitiría privarse de los talentos de Gastoldi.

Ese año y en 1585-6, Gastoldi actuó como maestro di cappella en lugar de Giaches de Wert, que había caído enfermo; en 1588 sucedió a  Wert como maestro di cappella, puesto que retuvo hasta su muerte. Para la representación de "Il pastor fido" de Guarini, en 1598, Gastoldi compuso el "Ballo della cieca", un momento notoriamente difícil en la obra que había frustrado anteriores intentos para producirlo; la música de Gastoldi se publicó en su "Quarto libro de madrigali" de 1602. Uno de sus últimos encargos en la corte fue componer música para uno de los intermedii proyectados para acompañar "L’Idropica" de Guarini, realizada en 1608 como parte de las largas celebraciones con motivo del matrimonio del Príncipe Francesco Gonzaga con Margarita de Saboya. En su testamento Gastoldi dejó su colección de música sacra al capítulo de Santa Bárbara y sus ediciones de madrigales a Fulvio Gonzaga, Marchese de Vescovato y dedicatario de la "Messe e motetti … libro primo" de 1607. 

Edición discográfica con una obra de Giovanni Giacomo Gastoldi

Gastoldi compuso varios madrigales, una variedad de música sacra vocal, y poca música instrumental. La mayoría de las composiciones populares de Gastoldi durante su vida, y durante algún tiempo después de su muerte, fueron sus ballettos, de los que publicó dos colecciones: una para cinco voces y una para tres. La música de los Balleti tenía básicamente una textura simple de acordes, declamación rápida y acentos rítmicos a cargo del despliegue de contrapunto como debe esperarse de su relación cercana con la música de baile.

La colección para cinco voces, publicada en 1591, se reimprimió unas 30 veces, tanto en Venecia como al norte de los Alpes (el último en 1657). El éxito de estos trabajos debe atribuirse a su simplicidad y belleza melódica. Compositores como Vecchi, Banchieri, Hassler y Morley fueron enormemente cautivados por esta creación musical.

Cada balletto lleva un título caracterizando (por ejemplo ‘Il Piacere', ‘La Bellezza', ‘Amor Vittorioso'), pero no hay ningún esfuerzo por representar estas características en la música, y de hecho sería difícil  hacerlo así dado las limitaciones del género. El libro termina con una mascherata para seis voces y un coro de ocho voces; ambos son probablemente remanentes de obras teatrales.

Es cierto que muchos frotolle, villancicos y chansons franceses estaban íntimamente relacionados con el baile, pero parece seguro que Gastoldi fue el primer autor con talento, probablemente desde el siglo XIII, que compuso canciones para bailar modeladas sobre normas instrumentales, y eran perfectamente apropiadas para tocarse sólo con instrumentos.
Sus composiciones más simples son los salmos para dos voces de 1609, una sucesión de 14 obras junto con un Magnificat, mientras la colección de 1601 para ocho voces usa doble coro y técnicas de alternatim, una especialidad de la práctica de Santa Barbara. . .