No se conoce el año de su nacimiento. Conocido como "Il Pesarino", aparece mencionado por primera vez como contralto en la Santa Casa, Loreto, en 1593 y 1594. Desde entonces hasta 1602 estuvo en el servicio de Monseñor Giuliano della Rovere en Urbino, y probablemente fue durante estos años que también le sirvió al Duque de Urbino, como menciona en la dedicatoria de su libro de madrigales de 1614 (Giuliano era un pariente del duque). Era un virtuoso falsetista, lo que hizo pensar a algunos que fuera un castrato.

Fue organista de la Catedral de Pesaro –de ahí viene su apodo– desde 1602 a 1605, cuando se hizo músico del Obispo de Padua. Entre 1608 y 1624 siguió una carrera independiente en Venecia como cantante, intérprete del chitarrone y compositor, frecuentemente tocando como solista o miembro de un grupo contratado en la cappella de San Marco y para la celebración de días de fiesta en la cofradía de San Rocco. Evidentemente su fama como cantante se había extendido en ese momento, cuando era uno de los visitantes más distinguidos.

Edición discográfica con una obra de Bartolomeo Barbarino

Entre 1625 y 1639 nada se sabe de su paradero, pero el 30 de mayo de 1639 y el 29 de diciembre de 1640 recibió pagos por actuar como  instrumentista en San Marco, Venecia, donde su hijo, Francesco Pesarin, se había hecho recientemente miembro del coro de la cappella.

Barbarino fue uno de los primeros monodistas, y uno de los más entusiastas, pues casi todo lo que escribió, sacro así como secular, es para voz sola y continuo. La mayoría de sus más o menos 120 monodias seculares son madrigales; algunos responden expresivamente al tipo más patético del texto, otros incluyen un buen trato de escritura tipo aria más brillante. Excepcionalmente él nombraba a los poetas a cuyas obras puso música, y él mismo escribió algunos de los poemas. En su colección de 1617 hay tantas monodias como madrigales de tres partes; muchos de éstos madrigales de varias partes (y otros de un manuscrito) existen en versiones solas similares por el compositor. Además, Barbarino sugería en el prólogo a la colección de 1617 que cada voz fuera acompañada por su propio chitarrone; para este efecto proporciona una línea de continuo separada en cada una de las partituras. "Misero e mesto" es un ejemplo particularmente bueno de la textura fragmentaria usada en los tríos, las tres voces vienen juntas sólo en las cadencias; y el uso muy libre de inflexión cromática produce un sentido armónico voluntarioso y modulaciones abruptas. Algunas de las canzonettas de 1616 también son voluntariosas, aunque sus melodías son predeciblemente más pegajosas.

El primer libro de Barbarino de motetes solos contiene los ejemplos supervivientes más antiguos de monodias sacras cantadas en contextos litúrgicos: según la dedicatoria, el compositor escribió mucha de la música en los años 1590 y la cantó en la misa, con [su] voz ronca. En el prólogo de uno de sus libros de motetes, Barbarino escribió que cantaría sus obras con acompañamiento de chitarrone, "porque mi voz es ronca y débil". La inclusión de numerosos motetes Marianos, sobre todo las cuatro antífonas Marianas, en su segundo libro de motetes solos hace pensar en la relevancia de esta colección para su carrera independiente en Venecia, una ciudad particularmente notable por su devoción a la Virgen.

Estaba tan involucrado como cualquiera de los seguidores de Giulio Caccini sobre la calidad de ornamentación que debía aplicarse a la música monódica, y en su segundo libro de motetes solos dio dos versiones de la línea vocal, una simple, una ornamentada, de las que mucho puede deducirse sobre el gusto contemporáneo en el embellecimiento de la música de iglesia (y otras). En una nota introductoria explica cómo algunos cantantes habían encontrado dificultad con las divisiones en su primer libro de motetes y que las versiones simplificadas eran para ellos, así como siendo un contorno básico que los cantantes experimentados podrían embellecer cuando ellos desearon. Las versiones ornamentadas, dice, eran para aquéllos que podían cantar ornamentos pero no podían improvisarlos.