De familia noble y musical, hijo del arquitecto Tommaso del Cavalieri y de Lavinia della Valle; pertenecía a la familia Orsini Cavalieri fundada por Mario, hijo de Gabriele Orsini y de Giovanna de Militibus o de’ Cavalieri, que asumió la herencia y el nombre de la madre; fue desde 1578 a 1584, organista del Oratorio del Crocifisso en San Marcello de Roma y organizaba las representaciones de la Cuaresma. El padre, coleccionista de esculturas antiguas, alumno y amigo del genio Miguel Angel Buonarroti, sin duda contribuyó en gran medida a la educación artística de su hijo, prodigándose para calificarlo en su posición como superintendente de las artes en la corte de los Médicis.

La primera documentación sobre Cavalieri data del año 1572; el 3 de agosto participó en una asamblea de la Congregación del Oratorio de la SS. Crocifisso en San Marcelo y el 13 de octubre de ese año, junto con su hermano mayor, Mario, se convirtió en funcionario de aduanas de la 'gabella dello Studio'. El padre compró también para él el cargo de auditor de puertos y puentes. En 1571, 1577 y 1587 Cavalieri fue elegido líder de San Eustaquio.

Busto de Emilio de Cavalieri en la Basílica dell'Ara Coeli, Roma

Desde 1577 organizó la ejecución de la música para la cuaresma en el Oratorio de San Marcelo, función realizada antes por Mario. Hasta 1584, y nuevamente en 1597, fue responsable de los pagos de los músicos, y el constante incremento de los gastos indica que llevó a cabo mejoras considerables en la calidad y cantidad de la música. El 8 de noviembre de 1585 Cavalieri fue nombrado uno de los dos agentes encargados de la construcción de dos nuevos órganos (o un doble órgano) para Santa Maria in Aracoeli; luego dirigió el trabajo de eminentes fabricantes de órganos, como Domenico y Benvenuto Benvenuti, Francesco Palinieri y el escultor en madera Giovanni Battista Montani. Los instrumentos sólo se completaron después de la muerte de Cavalieri por Luca Blasi y quemados por las tropas francesas en 1798.

El 30 de octubre de 1587, diez días después de la ascensión de Ferdinando de Medici al trono de Toscana, sucediendo a su hermano Francesco como gran duque, Cavalieri le escribió haciendo alusión a sus deseos de servirle. Alrededor del 23 de enero de 1588, fecha de su primera carta escrita desde Florencia, su deseo de un cargo en la corte de los Medici fue concedido. Ferdinando por cierto había conocido y apreciado a Cavalieri cuando era cardenal en Roma, y ahora lo convertía en una figura clave en su programa de desarrollo de las artes y las industrias en Toscana. Esto fue confirmado en una autorización de 9 de septiembre de 1588 que lo nombraba superintendente del arte, vestuario, fiestas, teatro y música de sus artistas (excepto el orfebre Bylevelt y el escultor Giambologna), artesanos y músicos en Florencia. Su salario mensual de 25 escudos era superior al de los secretarios de estado Belisario Vinta y Lorenzo Usimbardi; también se le dio un apartamento en el palacio Pitti.

Una de sus primeras tareas en Florencia fue la organización de las celebraciones con motivo de la boda de Ferdinando de Medici con Cristina de Lorena en 1589, sobre todo los famosos intermedi presentados el 2, el 13 y el 15 de mayo en el teatro de los Uffizi. Así, Cavalieri se responsabilizó de la escenificación de la más grandiosa serie de intermedi jamás conocida en Florencia. Ottavio Rinuccini suministró la mayor parte del texto de las veintinueve canciones de los seis intermedi, Cristofano Malvezzi y Luca Marenzio la mayor parte de la música. Además de madrigales polifónicos de estos compositores, Antonio Archilei, Giulio Caccini, Iacopo Peri y Cavalieri compusieron cada uno una pseudo monodia, es decir, un solo con adornos improvisados. El solo de Cavalieri "Godi turba mortal", con el texto de Rinuccini, fue cantado por el célebre sopranista Onofrio Gualfreducci.

Edición discográfica de "Rappresentatione di anima e di corpo" de Emilio de Cavalieri

Desde 1587 a 1602, viaja con frecuencia a Roma como encargado de negocios del duque de Florencia, aprovechó para asistir a la Chiesa Nuova. También compuso una serie de pastorales a lo largo de la década siguiente en Florencia, mientras se ocupaba de una serie de tareas diplomáticas en Roma. Su “Rappresentatione di anima e di corpo” fue interpretada en 1600 en el Oratorio del Crocifisso. Su música la había escrito en colaboración con Dionisio Isorelli. A menudo se le cita entre los primeros representantes de la creación del género "Oratorio", si bien esta obra pertenece más bien al género de sacra rappresentatione, y su estilo es una consecuencia de las piezas teatrales que Cavalieri se dedicó a promocionar en Florencia.

En 1590 colaboró con la poetisa Laura Guidiccioni escribiendo la música, hoy perdida, de las pastorales “Il Satiro”, “La Disperazione di Fileno”, “Il Gioco della cieca” (1595), en las que hizo sus primeros ensayos de canto monódico. Además de su actividad musical, trabajó como diplomático para los papas Inocencio IX y Clemente VIII.
Puesto que las pastorales de Cavalieri preceden a la primera ópera de Iacopo Peri, su significado histórico depende en gran medida de si empleaban al menos el nuevo estilo recitativo para que pudieran ser consideradas como los primeros melodramas. En cualquier caso, Cavalieri es el primer compositor, del que se conoce el nombre, que supo adaptar a la música un espectáculo dramático completo; cultivando la pastoral estableció el género literario de los primeros libretos de ópera. Cavalieri debe ser considerado el verdadero instaurador del estilo monódico teatral, aunque esto no fuera reconocido por sus oponentes florentinos (Iacopo Peri y Giulio Caccini). Su música era muy avanzada para el estilo de su época, su música vocal tiene una línea melódica muy adornada y expresiva, característica que define al barroco temprano. Su estilo musical fue adoptado por otros compositores de la escuela romana del siglo XVII, Domenico Mazzocchi, Giacomo Carissimi y Alessandro Scarlatti, fueron algunos de ellos. Fue pionero en el uso del bajo cifrado.

Uno de los principales intereses de Cavalieri en Florencia siguió siendo la construcción de órganos. Se llevó consigo a Roma a Francesco Palmieri, y entre 1588 y 1591 tenía no menos de seis órganos construidos en las fábricas de Palinieri, Alessandro Avanzati y Francesco Maria Galganetti. Su mayor proyecto, desde 1592 hasta su muerte, fue la construcción de tres órganos enarmónicos por obra de Palmieri en Florencia y Pisa. Además de dirigir a los constructores de órganos y a numerosos artistas y artesanos que se habían establecido en el palacio de los Uffizi, Cavalieri es mencionado también, en 1598 y 1599, como supervisor de la 'nueva elaboración de los cristales'. Fue aquí que la técnica de fusión y de colada del cristal tuvo sus primeros desarrollos. Varias veces Cavalieri también se esforzó por llevar mármoles antiguos de Roma a la corte florentina, alimentando su pasión de coleccionar pinturas y otras obras de arte. Un proyecto que le provocó tristeza en sus últimos años fue la construcción de un modelo de madera de un copón para la capilla de los príncipes en San Lorenzo por el arquitecto romano Giacomo Della Porta, ejecutado por el escultor en madera G. B. Montani. Aunque el trabajo fue elogiado por Cavalieri y por Della Porta, no satisfizo al gran duque; el pago de Montani era postergado y el modelo no se utilizó cuando se iniciaron las labores de la capilla en 1604.

Desde su llegada a Florencia durante el invierno de 1587-1588, hasta el retiro definitivo en su ciudad natal en el otoño de 1600, Cavalieri regresó no menos de seis veces a Roma entre septiembre de 1591 y abril de 1600. Llevó a cabo el primero de estos viajes como agente diplomático del gran duque; cuando Gregorio XIV se enfermó gravemente, fue enviado a Roma en previsión de un futuro cónclave. Tenía la tarea de dar noticias en Florencia, de expresar a los aliados de los cardenales los deseos de los Médicis y de ganar nuevos adeptos a la causa Toscana, ofreciendo en particular pensiones secretas a los cardenales Filippo Spinola y Ottavio Paravicini.

Durante la última enfermedad del Papa Inocencio IX, en diciembre de 1591, se puso nuevamente en camino a Roma, pero se vio obligado a volver a Florencia a causa de las inundaciones. Los celos, siempre presentes en la mente de los florentinos hacia los romanos en la corte del gran duque, habían provocado desde entonces rumores de 'reformas' en su contra. En los años que siguieron, las tensiones con Florencia y la amargura en las cartas de Cavalieri aumentaron considerablemente, llegando a un clímax en noviembre de 1600 después de la ópera de sus rivales "Euridice" y después rumores, probablemente infundados, de que Cavalieri había sido despedido de la corte. Estos y otros disgustos lo convencieron de retirarse definitivamente a Roma y no volver más a Florencia. Cavalieri redactó su testamento en 1594 y nuevamente en 1599, cuando sintió que su salud fallaba. A pesar de que sufría frecuentes aunque insignificantes enfermedades en los años siguientes, la muerte lo sorprendió repentinamente en Roma el 11 de marzo de 1602. Sus restos fueron enterrados en la capilla de la familia (la capilla de San Gregorio) en Santa Maria in Aracoeli. Cristofano Malvezzi y Sebastiano Raval escribieron madrigales dedicados a él. Aunque Cavalieri, en sus actividades y la posición social fue mucho más que un músico, es sólo como tal, que ahora se lo recuerda.