Parece haber pasado su vida entera en Florencia como músico intérprete y compositor. En 1613 se hizo instructor de canto llano de los clérigos jóvenes de San Lorenzo, un puesto previamente ocupado por su hermano. En 1614 él, junto con los compositores diletantes Giovanni del Turco y Francesco Arrighetti, invirtieron en la imprenta florentina de Zanobi Pignoni, pero los arreglos duraron sólo un año, durante cuyo tiempo la prensa publicó música de Del Turco, Caccini, Antonio Brunelli, Domenico Visconti, Raffaello Rontani y Marco da Gagliano. Documentos existentes muestran que Gagliano abasteció de música a varias iglesias, cofradías religiosas y academias de Florencia para fiestas especiales y observancias locales; sus cuatro colecciones publicadas incluyen algunas de esas obras. Incluso a una edad temprana se convirtió en miembro de la Compagnia dell'Arcangelo Raffaele, una cofradía religiosa laica de Florencia, asumiendo, en diciembre de 1622, el título de maestro di cappella, puesto que ocupó hasta noviembre de 1625.

Edición discográfica de obras de Marco da Gagliano, que incluye una obra de Giovanni Battista.

En esta condición compuso varios diálogos de Navidad, insertos en la colección "Varie musiche di Giovanbatista da Gagliano libro primo", publicada en Venecia en 1623; contiene una buena cantidad de música sacra, incluye varios madrigales interesantes y piezas estróficas; entre las últimas está "Ah ladra d’amore",  en la que cada verso está en una clara forma ternaria anunciando el aria da capo. Desde el 6 de enero de 1621 figuró también como músico (cantante) en Santa Maria del Fiore; el 6 de septiembre de 1621 es incluido por primera vez en las cuentas de sueldos de la Catedral de Florencia, como cantante ('musico'), y el 1 de octubre de 1624 se le dio el mismo título en la corte de Médicis, donde también actuó como intérprete de tiorba.

En estos años se ganó la estimación y el favor de los Medici tanto como tiorbista como autor de música teatral: en 1622 compuso, en colaboración con Francesca Caccini, "Il martirio di s. Agata", obra del literato Iacopo Cicognini, que recibió siete representaciones en Florencia en enero y febrero de 1622 por la Compagnia di S. Giorgio, y se repitió en junio siguiente y en varios ocasiones subsiguientes hasta por lo menos el Carnaval de 1642; fue repuesta el 22 de junio de 1624 en el Palacio del cardenal de Medici.

Más tarde, a pesar de los muchos compromisos en la corte del Gran Duque, no dejó de lado la producción de música sacra: en 1626 hizo imprimir la colección "Motetti per concertare a due, tre, quattro, cinque, sei e otto voci" (Venecia, A. Vincenzi) y en 1634 publicó por el mismo editor el volumen "Psalmi vespertini cum litaniis beatissimae Virginis quinis vocibus modulandi". Esta producción debió obtener una gran aceptación, puesto que a la muerte de su hermano (25 de febrero de 1643), se le ofreció el cargo de maestro di cappella en San Lorenzo, cargo que ocupó desde el 9 de junio de 1643(habiendo llevado a cabo los deberes durante 19 años debido a la mala salud de su hermano), pero se le privó del título real porque no era sacerdote. Pertenece a este período "Il secondo libro de motetti a sei et otto voci per concertarsi nell'organo, e altri strumenti" (Venecia, 1643), última colección de la que se tiene noticia.

Émulo de su hermano en el estudio del contrapunto, Giovanni Battista se dedicó principalmente a la composición de música sacra, actividad que lo vio ocupado en las principales sedes de la vida religiosa de Florencia: la basílica de San Lorenzo y la catedral de Santa Maria del Fiore. En línea con las tendencias musicales de la época, supo conciliar las tradiciones polifónicas con los nuevos requisitos estilísticos sugeridas por la aparición de la monodia acompañada. Este espíritu de modernidad, ya presente en las colecciones de música eclesiástica, debió ser más evidente en el campo teatral, donde se valió de la colaboración de Francesca Caccini, figura prominente del ambiente "cameratistico" florentino.

De esta producción, la totalidad de temas sagrados, se ha perdido la música; se conservan los libretos, publicados en Florencia, de los siguientes oratorios: "La benedizione di Iacob" (G. M. Checchi, 1622), "Il gran Natale di Christo" (I. Cicognini, 1622), "La celeste guida" (idem, 1624) y el ya citado "Martirio di s. Agata" (idem, 1624). De las numerosas composiciones sacras se recuerdan, además de las obras ya mencionadas, un "Salve Regina a 4 voci" publicado en Venecia en 1603 y, conservado en manuscritos en el archivo de Santa Maria del Fiore, un "Requiem", un "Benedictus a 5 voci" y varios motetes.