La mayoría de los datos biográficos sobre Sebastian Knüpfer vienen de un anuncio publicado con motivo de su muerte. La música le fue enseñada primero por su padre, Thomas Knüpfer, un Kantor y organista en Asch. También estudió regularmente con un tutor no identificado que vivía cerca de Asch, de quien obtuvo una sólida conexión y amor duradero por varias disciplinas escolásticas. A la edad de 13 años entró en el Gymnasium Poeticum de Regensburg y permaneció allí durante ocho años; su maestro más importante allí fue el director local Balthasar Balduin. Durante este extraordinariamente largo periodo se convirtió en un hombre muy versado en las tradiciones musicales de la ciudad (como los trabajos de Andreas Raselius), estudió órgano, quizás con Augustin Gradenthaler, y dominó varios temas humanísticos, sobre todo las artes poéticas y filología. Sus logros como estudiante fueron apoyados por becas de la ciudad de Regensburg, y fue recomendado por miembros influyentes del personal del Gimnasio y del concilio de la ciudad, algunos de estos últimos proporcionándole favorables testimonios cuando se trasladó a Leipzig en 1654. No se sabe por qué fue allí, pero en vista de su deseo de toda la vida por mejorar su mente, posiblemente fue porque  planeaba entrar en la universidad. No lo hizo, sin embargo.

Edicicón discográfica de música sacra por Sebastian Knüpfer

Durante sus primeros pocos años en Leipzig, Sebastian Knüpfer dio lecciones de música y cantó como bajo en coros de iglesia, desplegando bastante talento como para cantar como solista. Solicitó el puesto de Thomaskantor cuando Tobias Michael murió el 26 de junio de 1657, y fue nombrado el 17 de julio; los cuatro otros candidatos a quienes le prefirieron  incluían a Adam Krieger. En 1658 se casó con María Sabina Hagen, con quien tuvo tres hijos y dos hijas.

En Knüpfer la Thomaskirche encontró un Kantor y la ciudad de Leipzig un director de música que se acercó al calibre musical e intelectual de Sethus Calvisius y Johann Hermann Schein, los dos predecesores de Tobias Michael. Durante sus 19 años de permanencia Leipzig se volvió una vez más la ciudad musical principal de Alemania central luego del marcado declive que fue el resultado de la Guerra de los Treinta Años, la larga ocupación sueca de la ciudad y la enfermedad prolongada de Tobias Michael. Knüpfer comenzó así un periodo final de excelencia musical en Leipzig, que culminó en las carreras de sus tres sucesores, Johann Schelle, Johann Kuhnau y Johann S. Bach. Aunque nunca estudió en la universidad, continuó los estudios de filosofía (con Johann Adam Scherzer) y filología con miembros de la facultad y se pensaba que era un miembro de la comunidad académica. Fue alabado por su dominio de las fuentes clásicas acerca de la música, de las que demuestra ser un maestro en las ediciones de Meibom publicadas en 1652; estudió los tratados, entre otros, de Guido de Arezzo, Boethius, Berno de Reichenau y Kircher.

Además de su carrera productiva como Kantor se le conoce por haber viajado a Halle para dirigir su propia música para el estreno de nuevos órganos, para el Marktkirche el 15 de febrero de 1664 y el Ulrichskirche el 16 de noviembre de 1675; también dirigió un programa de música para el centenario del Gymnasium de Halle el 17 de agosto de 1665. Su círculo de colegas musicales incluyó a muchos hombres importantes de la música alemana del siglo XVII, como Pezel, Johann Rosenmüller y Johann Kaspar Horn, y bien puede haber conocido a Heinrich Schütz. Que era considerado como una de las figuras intelectuales destacadas de Leipzig lo  indica el raro honor de serle otorgado un entierro académico en la universidad aunque nunca se había conectado oficialmente con ella.

La producción de Sebastian Knüpfer consiste casi completamente en obras sacras con textos en latín o en alemán. Muchos están perdidos, y de aquéllos que sobreviven algunos se han publicado en ediciones modernas. La mayoría están en el estilo tradicional y forma del  concierto vocal del siglo XVII e incorporan muchas de las características de obras similares de Heinrich Schütz -aunque sin rastros del inigualable estilo personal de este último. Las formas de gran coral son reforzadas por una orquesta de tamaño sustancial (la mayoría normalmente con dos violines, tres violas, fagot con continuo, clarines, trombón y timbal), que apoyan la parte coral así como interponen toda la forma de efectos de colorido concertado. La escritura de las corales pueden ser masivamente cordal o intrincadamente polifónica, y hay varios pasajes más simples concertados para solistas sólo apoyados por el continuo. Knüpfer frecuentemente basó sus trabajos alemanes en el texto y melodía de una coral, y era un maestro en derivar ideas de contrapunto de la fragmentación motivacional de la coral.

La música de Sebastian Knüpfer es principalmente seria y profundamente devota, aunque publicó una colección de madrigales seculares y canzonettas (1663) que escribió para el estudiante universitario con quien trabajó en el collegium musicum de Leipzig. Su dominio del contrapunto, el poderoso drama de sus ideas temáticas, su instrumentación inteligente y la variedad de su línea vocal contribuyen a la impresión de él como un predecesor digno de Bach, muchas de cuyas cantatas de iglesia de Leipzig pertenecen primero a una tradición desarrollada por Knüpfer. Escribió motetes, conciertos sacros, cantatas y misas. Compuso para la coronación del emperador Leopoldo I en 1658 y por la paz de Aquisgrán en 1668. En 1663 publicó una colección de madrigales y canzonettas.

En 1925 se inauguró en Asch una plaza que lleva su nombre.