Era parte de una distinguida familia de músicos de origen judío. Su madre se llamaba Laura Bassano y su padre era Joseph Lupo, intérprete de cuerdas y compositor de Venecia que había venido primero a Amberes y luego a Londres, donde nació Thomas. En 1588 se unió al conjunto de violines en la corte de la Reina Elizabeth I. Tenía sólo 16 años y evidentemente no se le pagó por sus servicios hasta 1591. Thomas retuvo este puesto, o variantes del mismo, por toda su vida. Durante la era Jacobina sirvió tanto en la casa del Príncipe Henry (después de 1610) como del Príncipe Charles (después de 1617).

Un registro superviviente de 1627 indica que estaba en problemas financieros, y tuvo que firmar por £100 a cuenta de sus futuros ingresos para pagar a sus acreedores: el informe agrega que su esposa intentó violentamente impedirle hacer tal cosa.

Lupo fue uno de las figuras principales en el desarrollo del repertorio para conjuntos de viola. Además, fue un significativo compositor de música sacra vocal. Escribió una cantidad considerable de música probablemente para el conjunto de violines de la corte, sin embargo casi nada de ella sobrevive; se ha supuesto que mucho del repertorio anónimo para este grupo es de Lupo.

La mayoría de la música para violas que Lupo escribió, para dos, tres, cuatro, cinco y seis partes, data de su empleo en la casa del Príncipe Charles. Muchas de las piezas usan un estilo contrapuntístico y textural que recuerda al madrigal italiano, sobre todo las piezas para cinco y seis voces: en particular imitó el estilo de Luca Marenzio, cuyos trabajos eran muy conocidos en Inglaterra, habiendo utilizado una gran parte de la música transalpina de Nicholas Yonge de 1588, que inició la boga de los madrigales en Inglaterra.

Su música concertada en tres y cuatro partes es más experimental y usa a menudo combinaciones raras en otros compositores de la época, como tres bajos juntos, o tres tiples juntos. Alguna de la música concertante fue diseñada para ser acompañada por órgano. Junto con Orlando Gibbons, John Coprario y Alfonso Ferrabosco fue uno de los desarrolladores principales del repertorio para viola da gamba.

Los tipos específicos de composiciones instrumentales de Lupo incluyen fantasías (12 para seis partes, 35 para cinco partes, 13 para cuatro partes, y 24 para tres partes); pavanas, galliardas y Almands (allemandes). Algunas de las fantasías son transcripciones directas de madrigales italianos. Su hermano Horatio también se dedicó a la música.