Estudió en el seminario local, donde fue iniciado en la vida eclesiástica, recibiendo la tonsura el 9 de mayo de 1614. En ese momento ya había cambiado el nombre de bautismo de Virginio en Virgilio. Se trasladó a Roma, donde estudió música con su hermano Domenico, que desde 1621 estaba al servicio del cardenal Ippolito Aldobrandini. El obispo I. Fabiani lo destinó al servicio en la catedral, y cuando creó un servicio regular de música lo nombró maestro di cappella el 24 de agosto de 1622. En este cargo permaneció durante poco más de un año; el 22 de de noviembre de 1623, cuando en su lugar fue nombrado Mazzocchi Michelino, ya se había trasladado a Roma, donde perfeccionó su formación musical y comenzó la actividad de la composición. Junto con Domenico (y tal vez a través de él) Mazzocchi apareció en la antología de motetes "Sacri affetti contesti" editada por F. Sammaruco y publicada en Roma en 1625; su "Surge amica mea, per 3 soprani e basso continuo", muestra una sólida formación contrapuntística y una eficaz interpretación del texto. Estas cualidades sugieren que en esa época y hasta 1628 Mazzocchi había estudiado no sólo con su hermano, sino también con un contrapuntista de estilo severo, probablemente con Paolo Agostini (de Vallerano en la diócesis de Civita Castellana), desde 1626 maestro di cappella en San Pedro.

Fue probablemente como resultado de la influencia del cardenal Aldobrandini que Virgilio, aproximadamente en 1625, entró al servicio del cardenal Francesco Barberini, sobrino del Papa Urbano VIII, y fue sin duda Barberini quien abrió el camino para la carrera de Virgilio como músico de iglesia. Desde quizás 1626 hasta 1629 fue maestro di cappella en la iglesia del Gesù y enseñó en el Collegio Romano Jesuítico, reemplazando al maestro Alessandro Costantini; en esta su primera asignación estaba ocupado en dos campos muy diferentes: el servicio de música sacra en la iglesia de los jesuitas (de la que formaban parte los estudiantes del seminario) y música para los espectáculos de carnaval en el seminario. Para este colegio escribió un intermedi musical para la obra en latin "Crispus" (1597) de Bernardino Stefonio (febrero de 1628) y probablemente la música para otras dos tragedias representadas en 1628 y en 1629. Durante su servicio en el seminario, el cercano Colegio Romano fue visitado por el cardenal Francesco Barberini; para la ocasión fue ejecutado un poema laudatorio compuesto por Mazzocchi ("Chi mi raddoppia il giorno"), del que se conserva la música; el manuscrito lleva una dedicatoria firmada por Mazzocchi. El homenaje fue agradecido (el favor del cardenal sería decisivo para la vida y la carrera del compositor). En 1628 el cardenal Barberini asistió a la ceremonia de graduación del futuro cardenal F. A. Rapaccioli, donde fue ejecutada una oda latina ("Hesperia modulatio"), presumiblemente también con música de Mazzocchi.

Edición discográfca de "Vespro della beata Vergine" de Virgilio Mazzocchi

De 1628 a 1634 Mazzocchi fue también maestro di cappella de la iglesia de San Antonio dei Portoghesi, donde con especial solemnidad se celebraba la fiesta del santo titular. Mientras tanto era pasado del Jesús a la basílica de San Juan de Letrán, donde prestó servicio desde junio a septiembre de 1629: muerto todavía joven Agostini, Mazzocchi fue nombrado maestro de la Cappella Giulia del capítulo de San Pedro en el Vaticano (8 de octubre de 1629). En el prestigioso cargo en que permaneció hasta su muerte, continuando con la práctica de las ejecuciones policorales introducidas por Agostini en las principales fiestas de la basílica, con un esplendor sonoro que asombró a sus contemporáneos: en la fiesta de San Pedro y San Pablo de 1637 llegó a colocar cantantes e instrumentos en la linterna de la cúpula, solución repetida en 1639 y en 1644. El efecto de un coro 'de eco', que desde la lejanía de la cima del templo respondía a aquello que en "Della musica dell’età nostra" (1640) P. Della Valle llamaba 'gran musicone', compuesto de otros numerosos grupos en diferentes lugares, despertó admiración y fue imitado por otros autores.

Desde aproximadamente 1630 los deberes de Mazzocchi como maestro y músico de la corte aumentaron rápidamente, y a veces delegó en Domenico la composición de música para las fiestas religiosas. Además de lo de San Pedro, Mazzocchi tenía otros deberes: maestro di cappella para las fiestas del Colegio Inglés (desde 1632), maestro para la música interpretada en el oratorio del Ss. Crucifijo en la cuaresma de 1634 y de 1639, virtuoso al servicio directo del cardenal Barberini (desde 1635), profesor de música de los estudiantes del seminario de San Pedro (desde 1637). También estuvo activo en el oratorio de los filipinos en la iglesia Nueva y en muchas otras iglesias de la ciudad, particularmente en aquellas relacionadas con el patrocinio del cardenal Barberini (S. Lorenzo in Damaso, Santa Agata dei Goti, San Giacomo alla Lungara, Santa Chiara, Santa Maria en Aquiro).

Estas diversas tareas comportaron una fecunda actividad como compositor de música sacra y secular, para el teatro, así como renombrado maestro. En este sentido, de gran interés es el testimonio de su alumno Giovanni-Andrea Angelini-Bontempi, futuro virtuoso de canto y compositor, quien describió cuidadosamente el método y el contenido de la escuela recibidos de aquel 'insigne profesor'. La posición de Mazzocchi en San Pedro se fortaleció cuando el cardenal Barberini se convirtió en arcipreste de la basílica; para la ceremonia de posesión se ejecutó música con tres coros y tres órganos compuesta por él (9 de noviembre de 1633). Mazzocchi también se dedicó al nuevo y rápidamenmte desarrollado género del oratorio. Dirigió la música para la Arciconfraternita del SS Crocifisso en San Marcello en la Cuaresma de 1634: diez diálogos latinos en cinco viernes consecutivos, cuatro de los cuales eran posiblemente de Domenico Mazzocchi, cuyo Coro di profeti para la Congregazione dell'Oratorio (h. 1635) también fue dirigido por Virgilio. En 1640 Mazzocchi participó en el Dialogo di Esther de Pietro Della Valle, tocando el cembalo triarmonico, un instrumento que producía, según G. B. Doni, los géneros de tono griegos antiguos.

Lápida en memoria de Virgilio Mazzocchi en la catedral de Civita Castellana, dictada por su hermano Domenico

Desde 1636 Mazzocchi también dirigió academias musicales para Francesco Barberini y la corte papal en el Palazzo del Quirinale. Allí realizó sus propios madrigales y cantatas probablemente, junto con otra música de, por ejemplo, Gesualdo y Domenico Mazzocchi. Los cantantes eran principalmente niños, las violas los instrumentos preferidos. Mazzocchi era conocido como un maestro excelente; sus alumnos incluyeron a G. A. Bontempi, Francesco Benedetti, Giovanni Carpano y M. A. Giroppi. Por voluntad del cardenal se estableció, en 1637, el seminario de San Pedro, con clérigos adolescentes del Seminario Romano para las funciones litúrgicas y musicales de la basílica, en una sede ubicada cerca de este; Mazzocchi fue su maestro y los utilizó en muchas ejecuciones, incluso fuera de San Pedro; probablemente compuso la música para sus recitados en latín durante el carnaval.

Como maestro di cappella de Francesco Barberini (desde 1636) y de la corte papal, Mazzocchi también tenía que proporcionar óperas. Barberini prefería historias de los santos, pero en el futuro admitió también temas clásicos y humanisticos: la primera producción de Mazzocchi, "L'Egisto" (o "Il falcone", 1637), estaba basada por el libretista Giulio Rospigliosi en una historia de Boccaccio. Para el cardenal puso en música dramas escritos por G. Rospigliosi (el futuro Clemente IX), preparados por G. L. Bernini o sus seguidores en espléndidas representaciones en el palacio Barberini y el vecino teatro de la familia, en la Cancillería o en el palacio Rusticucci en Borgo. De esta actividad quedan las partituras de "San Bonifatio", drama musical representado en la Cancillería en febrero de 1638 por una compañía de niños de 10 y 11 años, alumnos de Mazzocchi (entre ellos Angelini-Bontempi), de la comedia musical "Chi soffre speri" (en la versión de 1639 con adiciones de Marco Marazzoli: la original de febrero de 1637 se perdió), de la 'attione in musica' "San Eustachio", representada como intermedios para el drama latino "Susanna" en febrero de 1643, de la ópera musical "L’innocenza difesa", también llamada "La Genoinda" , de la que quedan sólo tres arias (Cancelleria, 29 de enero de 1641). Perdida es la música de odas latinas en el Collegio romano, así como aquella para el "Troades" de Séneca (palacio Rusticucci, Carnaval 1640, prólogo e intermedio sobre texto de Rospigliosi) con los coros y los soliloquios de la antigua tragedia compuestos en un estilo inusual para seguir la métrica del latín clásico; toda la música (excepo quizás un intermedio por Marazzoli) era de Mazzocchi.

A estos experimentos Mazzocchi era muy aficionado, ya que en la actividad desarrollada por el cardenal Barberini él estaba en estrecho contacto con el docto teórico y humanista G. B. Doni, partidario de la reanudación de los géneros y los modos de la antigua música griega. Al igual que su hermano Domenico, Mazzocchi utilizó el género cromático y experimentó el enarmónico, para lo cual, de acuerdo con el testimonio de Angelini-Bontempi, hacía practicar 'un brevísimo ascenso y descenso de voz', técnica reservada los 'más ejercitados y experimentados cantantes'. La experimentación incluía los instrumentos, fueran ellos el conjunto de cuerdas (violas) de las academias sostenidas por el cardenal Barberini o aquellos construidos especialmente; él mismo tocaba el clavicordio 'triarmonico'. Si sus composiciones habían sido publicadas en antologías (una versión del "Magnificat a 8 voces", en los "Salmi" de F. Costantini impreso en Orvieto en 1639; un aria para 2 sopranos en la "Raccolta d’arie spirituali" curada por V. Bianchi en Roma en 1640), el ya maduro Mazzocchi aún no había dado a la imprenta una colección propia; lo hizo con las "Sacri flores", publicadas en Roma en 1640 y dedicadas al capítulo de San Pedro, incluyendo motetes para 2-3 voces (uno para 4 voces del alumno M. A. Giroppi), destinados a la ejecución y a la enseñanza. Otros numerosos motetes suyos aparecieron en antologías de los años siguientes; sus otras obras se publicaron póstumamente hasta 1664.

En 1641, un gran espectáculo fue requerido por Francesco Barberini para el matrimonio de Marc'Antonio Colonna e Isabella Gioieni (cuñada de Anna Colonna Barberini). La primera representación de "La Genoinda", ovvero "L'innocenza difesa" tuvo lugar en el Palazzo della Cancelleria a fines de enero ante aproximadamente 100 señoras romanas y unos pocos caballeros; la música fue compuesta por Mazzocchi. Para el Carnaval de 1643 Francesco Barberini produjo una obra en latin, "Sancta Susanna", representada por estudiantes del seminario de San Pietro en el Palazzo Rusticucci.

La investigación en contra de los Barberini seguida a la muerte del Papa Urbano VIII (23 de julio de 1644) y la fuga a Francia del cardenal Francesco (enero de 1646) produjo un descenso significativo en las actividades de Mazzocchi, al que también le quedaba poco tiempo de vida: fue a Civita Castellana con sus estudiantes para celebrar con música la fiesta de los santos patronos el 16 de septiembre de 1646, donde súbitamente cayó enfermo. Murió en Civita Castellana el 3 de octubre de 1646 y fue enterrado en la catedral. Su hermano Domenico, su único heredero, le hizo instalar una hermosa inscripción conmemorativa, con busto y brazos, que todavía existe en el pórtico de la iglesia. Unos días más tarde sus libros de música fueron vendidos en Roma.

Póstumamente se imprimieron en Roma en 1648 dos de sus obras: los solemnes "Psalmi vespertini" a cargo de su hermano y las "Piae meditationes" a cargo del beneficiado de San Pietro Q. Mozzani, que había establecido una práctica devotsa sobre la Pasión por los seminaristas de la basílica, práctica de la cual la colección contenía la música. La misa de las composiciones de Mazzocchi permaneció inédita. En la direción de la Cappella Giulia lo sucedió Orazio Benevoli, que siguió allí el estilo policoral. Un retrato de Mazzocchi, junto con aquellos de otros compositores famosos, provino del organista B. Gaffi, cuyos herederos lo mantuvieron en la cocina hasta la mitad del siglo XVIII; sin éxito trató de comprarlo el padre Giovanni Battista Martini.

Si en algunos aspectos de su producción de música profana u oratorios, incluyendo el interés en los géneros antiguos de acuerdo con las ideas de Doni, Mazzocchi está cerca de su hermano Domenico, él se aleja de ellas como una figura profesional de maestro di cappella activo en especial en el campo de la música sacra. Con un buen dominio del contrapunto, fue capaz de renovar la tradición polifónica romana ya sea adoptando sistemáticamente el estilo concertato, o bien por las eficaces frecuentes alternaciones entre solos y rellenos y los felices contrastes rítmicos y dinámicos. Entre las composciones sacras más valiosas se destacan aquellas publicadas en los póstumos "Psalmi" de 1648 (en particular los dos "Magnificat" y el "Beatus vir") y otras obras policorales conservadas en manuscritos (misas, salmos y motetes), como el "Beatum Franciscum a 4 cori, strumenti obbligati e basso continuo". Pero Mazzocchi era bien capaz de adoptar un estilo sencillo, tanto para los requisitos litúrgicos como en el estilo monódico presente en el las obras teatrales, de cámara y oratorios.