Estudió con Alessandro Milleville y según Agostino Superbi -en su obra “Apparato de gli huomini illustri della città di Ferrara” (1620)- tocó 'i primi organi' durante muchos años en Ferrara, antes de trasladarse a Roma en 1597. Tenía una mano muy delicada y rápida; tocaba a veces tan admirablemente que capturaba a la gente y los hacía sorprenderse realmente. Sin embargo, tuvo poca suerte en Roma. Por lo tanto Pasquini debió operar en Ferrara durante mucho tiempo, pero no hay certeza sobre la fecha de nacimiento o sobre los términos y la naturaleza de su servicio en la ciudad.

En los años 1580 enseñó clavicordio, órgano y composición a las hijas de Giovan Battista Aleotti, arquitecto de la corte de Ferrara, quien al dedicar a Ippolito Bentivoglio un libro de madrigales de Victoria Aleotti, su segunda hija (Venecia, 1593), la llama alumna muy precoz de Pasquini (entre los cuatro y los catorce años de edad); de hecho, habría sido el 'buon vecchio' Pasquini, que ya había sido maestro de música de la primogénita, quien indujo al padre a hacer monja a la niña en el monasterio de S. Vito, famoso por el concierto de las hermanas: debemos suponer por lo tanto que Pasquini tenía más de cuarenta años.

En 1583 su nombre aparece en una lista de organistas de la Academia de la Muerte de Ferrara, cargo ocupado previamente por Luzzasco Luzzaschi, y después de él por Girolamo Frescobaldi. Pasquini puede ser el ‘organista Ercole' mencionado en el testamento de Mario Bevilacqua de Verona en 1593 entre los asalariados de su famoso 'reducto' musical; en la misma ciudad 'ms. Hercule da Ferara' aparece como organista en Santa Maria in Organo desde mayo de 1592 hasta abril de 1593.. El mismo año se publicó en Verona su favola boscareccia titulada "I fidi amanti", escrita para el próximo matrimonio de Leonora d'Este con el príncipe Carlo Gesualdo. En esta obra, de la que sólo el texto sobrevive, Pasquini se dirige a Leonora como su patrocinadora. El 6 de octubre de 1597 Pasquini fue nombrado organista de la Capilla Giulia en San Pedro en el Vaticano. Tal vez no estaba del todo satisfecho con su condición en Ferrara, si es cierto que en 1591 trató en vano de conseguir un lugar de organista en la Santa Casa de Loreto, recomendado por don Cesare de Este de Módena.

En 1604 Pasquini resulta también activo en el órgano de la iglesia cercana de Santo Spirito en Saxia. Durante 1605 estuvo hospitalizado y el 19 de mayo de 1608 fue dado de baja del servicio en la Cappella Giulia justis de causis' (continuó tocando hasta el final del mes; su firma del 31 de mayo en el 'liber censualis' es el último documento conocido con respecto a él). Se supone que Pasquini se habría vuelto loco, pues en noviembre y diciembre de 1605 los recibos de salario suyos fueron firmados por un empleado del Hospital de locos. En su resolución los canónigos de San Pedro no especificaron las razones del despido. El 31 de octubre, Girolamo Frescobaldi tomó su lugar.

En virtud de las 30 composiciones para teclado que han sobrevivido en manuscrito, Pasquini debe ser mencionado entre los predecesores importantes de Frescobaldi. Las toccatas constan de varias secciones cortas que contienen la nueva figuración, acordes de séptima de dominante y armonías experimentales que generan gran tensión nerviosa. Las durezze e ligature están entre las obras más antiguas de este tipo. La mayoría de las canzonas son en tres secciones, con la central en tiempo triple. Los correntes son los ejemplos más antiguos conocidos en Italia; consisten en dos o tres secciones de longitud irregular. Sólo cinco de las composiciones vocales de Pasquini han sobrevivido. La más impresionante es el motete "Quem vidistis, pastores", que es para dos coros de cinco voces.

Cinco composiciones de Pasquini fueron publicadas en colecciones: un madrigal en el "Giardino de musici ferraresi" dedicado al Duque Alfonso II (Venecia, 1591); otro en la "Musica de diversi eccellentiss. autori […] sopra i Pietosi affetti del M.R.P. Angelo Grillo" (Venecia, 1604); dos motetes en "Sacrae cantiones" de la ferraresa Raffaella Aleotti (Venecia, 1593) y un tercero en "Scelta di motetti […] Libro secondo, opera quarta" a cargo de Fabio Costantini (Roma, 1618) dedicada al conde Cesare Bentivogli. En algunas de ellas la influencia de Andrea y Giovanni Gabrieli parece obvia, mientras en otras, tanto el texto como el estilo polifónico sugieren la adhesión a los ideales estilísticos del movimiento oratoriano. El inventario de 1665 de la perdida biblioteca del archiduque Sigismondo Francesco del Tirol menciona una "messa a 10 voci", una "messa a 3 cori sopra Vestiva colli", "madrigali a 5 alla Ser.ma Vergine" y una "opera 16 libri tuto di Hercule Pasquino" (la colección provenía de la casa del ferrarés Antonio Goretti, amigo de Claudio Monteverdi).

La música para teclado de Pasquini, que hasta donde sabemos permaneció inédita en sus días, es de calidad superior. Los manuscritos le atribuyen un madrigal 'passeggiato', dos ricercares, seis series de variaciones, once tocatas, diez canciones, una gagliarda, un ballet y dos correntes; otras piezas, recibidas en las mismas fuentes, podrían atribuirse a él. Las canciones exhiben una alta maestría contrapuntística. El tema de una de ellas es un simple trino, con su buena preparación y resolución. Las otras dos tienen temas que implican un intervalo de cuarta disminuida, precedido y seguido por segundas.