Estudió con Andrea Gabrieli y debe haberse establecido por consiguiente en Venecia antes de 1586. Había servido previamente como sacerdote en Capodistria. A fines de los años 1580 era tutor de Cesare Usper (muerto en 1589), hijo de Lodovico Usper (muerto en 1601), abogado y oficial menor de la cofradía de San Giovanni Evangelista, Venecia a quien Francesco dedicó sus "Ricercari". Adoptando el apellido de este patrocinador, Francesco Usper consagró mucha de su vida a la cofradía, a la que sirvió como organista (1596-1607), capellán (1607-24), maestro de coro (1624-26), director (capo) de la iglesia adjunta (1626-41) y funcionario administrativo (mansionario) (1631-41).

También estuvo activo esporádicamente en otras partes en Venecia. Fue organista de la iglesia de San Salvatore hacia 1605 y fue en esta condición que se le citó en 1615 por haber proporcionado uno de los temas imitativos que tuvieron éxito en dos cánones para cuatro voces en la colección de Romano Micheli "Musica vaga et artificiosa". Colaboró con G. B. Grillo y Claudio Monteverdi en la composición de una misa de réquiem (ahora perdida) para el Gran Duque Cosimo II de Medici, realizada en la iglesia de SS Giovanni e Paolo en  mayo de 1621; él escribió el gradual y el opúsculo.

Sirvió en San Marco como organista suplente de Giovanni Battista Grillo en 1622 y a comienzos de 1623. Sin embargo, fue defraudado en 1623 y de nuevo el año siguiente en sus esfuerzos por lograr allí una posición permanente como organista. En 1617 y 1623 fue contratado para la fiesta de San Roche (16 de agosto) en la cofradía dedicada al santo. Vivió cerca de Santa María Gloriosa dei Frari en la parroquia de San Stin.

Usper era extraordinariamente sensible a las palabras en sus obras vocales y a la forma en sus obras instrumentales. Continuó ciertas costumbres locales populares de finales del siglo XVI incluyendo un madrigal de batalla en su colección de 1619 y alguna música policoral de salmos en la de 1627. Él se veía a sí mismo como un exponente de estilos conservadores de composición, que contrastó en el prólogo de su colección de 1614 con la 'strepitosa' música que entonces se estaba poniendo de moda.
Tal conservatismo no logró, sin embargo, impedir su habilidad y eficacia componiendo en los más nuevos estilos acompañado y concertado.

Sus obras instrumentales, aunque pocas en número, son significativas por varias razones. Las cuatro arie francesi de su primera publicación están entre las primeras canzonas venecianas para conjunto. Sus dos sinfonías, dos canzonas, dos capriccios y una sonata sola en la  colección de 1619 muestran adelantos notables en la diferenciación de géneros instrumentales. Una sinfonía, proclamada por Alfred Einstein (1880-1952) como una precursora del concerto grosso, ofrece pasajes de concertino para flauta dulce y chitarrone que alternan con un ritornello homofónico para orquesta de cuerdas; pero los instrumentos de cuerdas y trombones todavía forman el núcleo de su orquesta, tal como en las de Giovanni Gabrieli.