Continuó su enseñanza con Giovanni Maria Nanino entre 1600 y 1607. Paralelamente, y hasta 1630, fue sacerdote y tenor solista en San Luigi dei Francesi, trabajando posteriormente en catedrales de Vallicella, Tivoli y Fermi. En 1628 llegó a ser Maestro di Capella en Sancto Spirito, en Sassia, Roma. Se unió al coro papal como contralto el 6 de diciembre de 1629, bajo Urbano VIII, y fue elegido su maestro di cappella para el año del jubileo de 1650. Permaneció en ese cargo por el resto de su vida. En 1640 sus compañeros cantantes lo eligieron para revisar los himnos de Palestrina (necesitados para la revision de los textos por Urbano VIII), que fueron publicados en Amberes en 1644. Sus contemporaneos claramente lo veían como un digno sucesor de Palestrina y un custodio del stile antico.

Casi todas las composiciones de Allegri están destinadas a la iglesia. Su numerosa producción incluye cinco misas, varios motetes, lamentaciones, algunos magnificat y concertini para voz solista. También escribió una sonata en cuatro partes para cuerdas que se considera como el prototipo más antiguo del cuarteto de cuerdas. La mayoría de esas creaciones se conservan perfectamente en forma de manuscritos.

La obra más conocida de Allegri es su puesta en música del salmo "Miserere mei, Deus" que data de 1638. Desde entonces ha sido uno de los orgullos de la Santa Sede y se interpreta regularmente en la Capilla Sixtina durante Semana Santa. Se dice que una prohibición papal no permitió la publicación o difusión del Miserere de Allegri por más de un siglo, con el fin de mantener la exclusividad. Quien lo hiciera sería excomulgado de la iglesia. Pero el joven Mozart, que tenía 14 años cuando visitó Roma con su padre en 1770, lo escuchó solamente una vez y luego lo transcribió. Entonces comenzó a publicarse. Escribió una gran cantidad de obras, tanto instrumentales como música coral sacra, parecidas a la de su mentor Nanino y a la de su antecesor Palestrina.