En 1595 fue empleado como organista en San Marcello, y probablemente se hizo maestro di cappella en la Basílica de San Giovanni en Laterano, después de Francesco Soriano, entre 1600 o 1601 y 1603. En 1609 sostuvo un puesto similar en la Catedral de Verona, su primer cargo fuera de Roma; se quedó allí hasta 1610, cuando volvió a Roma, se quedó, aparte de algunos viajes, hasta 1624, en una variedad de actividades (haciéndose sacerdote por fin en 1616). En 1624 tomó el puesto de director de coro del Rey Sigismund III de Polonia, en Varsovia. Polonia tenía varios activos centros musicales a fines del siglo XVI y comienzos del XVII, incluyendo Kracovia y Varsovia, y a menudo empleaba italianos y alemanes; Anerio fue uno de los extranjeros más distinguidos que fijó allí su residencia.

Lamentablemente nunca vio Roma otra vez; murió viajando a casa, estando en Graz, Austria, y fue enterrado allí el 12 de junio de 1630.

Giovanni Anerio fue un compositor mucho más progresista que su hermano, y en el ambiente conservador de Roma en el temprano siglo XVII, este era progresista de verdad. Muchos de sus madrigales eran monodias, incorporando un estilo que vino de Florencia y otros lugares del norte; sus motetes y misas, por otra parte, son conservadoras y usan el estilo de Palestrina, aunque los motetes incluyan el bajo figurado, otra innovación de la primera década del siglo XVII. Alguna influencia de Viadana es evidente en estos pedazos.

Algunas de sus misas son poli corales, una técnica que implicó múltiples grupos de cantantes, separados espacialmente. Mientras esta fue una técnica que se desarrolló también en Venecia, se extendió hasta fines del siglo XVI: casi todos los compositores de polifonía sagrada usaron técnicas poli corales en algún momento, sobre todo aquellos que trabajaron en grandes ambientes acústicos (como la mayor parte de catedrales en Europa).

El logro más importante de Anerio cuando joven, sin embargo, fue su “Teatro armonico spirituale” de 1619, que es posiblemente el primer oratorio. Este incluye el más antiguo obbligato escrito para instrumentos por la Escuela romana que sobrevive. La instrumentación es indicada con un cuidado insólito, y el instrumental alterno y pasajes vocales fueron enormemente influyentes en los trabajos de las décadas siguientes. A diferencia de los trabajos de la escuela Veneciana, muchos de los cuales eran esencialmente motetes grandiosos, el “Teatro armonico spirituale” era en italiano; este incluía historias relatadas melodiosamente, pero no actuadas (como sería posteriormente en la ópera); y las voces e instrumentos se alternaban  movimiento por  movimiento. La pieza incluía trozos de la historia del Hijo Pródigo y de la Conversión de Saul.

Fue un compositor prolífico, y escribió motetes, letanías, antífonas, "conciertos sacros", responsorios, salmos, madrigales, mucha música sagrada y secular miscelánea, así como un puñado de trozos instrumentales. La mayoría fueron publicados en Roma; ningún trabajo del período en que trabajó en Polonia aún han sido definitivamente identificado. La importancia principal de Giovanni en la historia de la música fue su contribución al temprano desarrollo del oratorio.